domingo, 21 de diciembre de 2008

Determinación de configuraciones relativas y/o absolutas por RMN

La determinación de configuraciones relativas y/o absolutas es uno de los aspectos más problemáticos en la elucidación estructural de compuestos orgánicos. En compuestos con propiedades conformacionales bien definidas, como sistemas rígidos, este estudio se puede hacer en forma rutinaria mediante experimentos de RMN de alta resolución. De esta forma, la determinación de las configuraciones relativas de compuestos cíclicos con anillos de tres a seis miembros, con varios centros quirales, puede ser llevada a cabo a partir de valores de constantes de acoplamiento protón-protón y/o mediante experimentos basados en el efecto nuclear Overhauser (NOE). Por otro lado, a pesar de que normalmente no se suelen emplear como rutina, las constantes de acoplamiento heteronucleares proporcionan información muy valiosa y pueden ser fácilmente determinadas a partir de experimentos HSQC o HMBC sin desacoplar.

Actualmente se pueden encontrar varias aplicaciones informáticas que permiten predecir NOEs y constantes de acoplamiento en forma teórica a partir de las estructuras químicas en 3D, o de un grupo de confórmeros. Por ejemplo, el programa MSpin (http://www.mestrec.com/) contiene varios módulos que permiten no solo la predicción de constantes de acoplamiento protón-protón, sino también la predicción de constantes de acoplamiento heteronucleares (varias de las cuales también están optimizadas para péptidos y glicósidos).

En el caso de sistemas flexibles, como cadenas carbonadas polisustituidas abiertas y compuestos macrocíclicos, la presencia de múltiples confórmeros hace que no se pueda aplicar la estrategia antes mencionada de forma directa, y por ende es necesario recurrir a otras alternativas. Algunos ejemplos que mencionaré a continuación son los métodos derivados de la técnica de Mosher y un método desarrollado más recientemente que se basa en el estudio de acoplamientos dipolares residuales.

Métodos basados en derivatización con agentes quirales (CDA):

Este es el método de elección para la asignación de configuraciones absolutas por RMN e involucra la derivatización del substrato (por ejemplo un enantiómero puro) con dos enantiómeros de un agente de derivatización quiral, dando lugar a dos diasterómeros.

El método de Mosher, implementado en 1973, utiliza MTPA (ácido metoxitriflurofenilacetico) como auxiliar quiral e involucra la comparación de dos espectros. La asignación de la configuración absoluta se basa en el uso de RMN para correlacionar la estereoquímica absoluta del centro quiral del agente auxiliar (de configuración conocida) con el del sustrato (configuración desconocida). Lo que se tiene en cuenta en este caso son los cambios en los desplazamientos químicos de los sustituyentes del carbono asimétrico del sustrato (L1 y L2) en los dos derivados. La diferencia de desplazamientos químicos tendrá signo opuesto en ambos sustituyentes, y dependerá de la estereoquímica absoluta del centro quiral del sustrato.

En general, la estructura de un auxiliar quiral debe incorporar grupos con funciones específicas:
- Un grupo polar o voluminoso para fijar una conformación particular.
- Un grupo funcional (por ej. ácido carboxílico) que dará lugar a la unión covalente con el sustrato.
- Un grupo que sea capaz de producir un efecto anisotrópico eficiente y orientado en el espacio (por ej. grupo aromático), que afecte selectivamente a los sustituyentes L1 y L2 del sustrato. Este apantallamiento / desapantallamiento asegura que los desplazamientos químicos de L1 y L2 sean diferentes en las dos especies (diasterómeros o confórmeros) que son utilizadas para la determinación de la conformación.

A través de los años se ha dado la evolución a reactivos mucho más eficientes, con posibilidades de ser utilizados en diferentes sustratos, y basados en el mismo principio (para mayor información ver Chem. Rev. 2004, 104, 17-117). Por otro lado, recientemente también han surgido métodos que solo requieren la preparación de un solo derivado. En este caso, se obtiene el espectro del derivado en las condiciones estándares y luego se induce un cambio conformacional en el derivado, para obtener el segundo espectro. Ésta modificación del equilibrio puede inducirse de dos maneras:

1) por reducción de la temperatura.
2) por quelación selectiva de uno de los confórmeros (por ej. utilizando sales de bario)

Acoplamiento residuales dipolares (RDCs):

Por último quería mencionar el método para la determinación de conformaciones y configuraciones de moléculas orgánicas mediante el estudio de acoplamientos residuales dipolares en diferentes medios de alineación. Esta es una técnica que se ha venido utilizando en RMN de proteínas, y recientemente se está empezando a aplicar con éxito en moléculas orgánicas. Solo se ha vuelto accesible a moléculas orgánicas muy recientemente, debido a la disponibilidad de medios de alineación compatibles con solventes orgánicos. (J. Magn. Res. 2003, 163, 353-359)

Esta metodología se basa en la obtención de pequeños grados de alineación de las moléculas en el campo magnético. El alineamiento molecular parcial conduce a un promedio incompleto de las interacciones dipolo-dipolo, dando lugar a acoplamientos dipolares D, que se miden en forma análoga a las constantes de acoplamiento J. Estos acoplamientos permiten agregar información a la determinación estructural, a través de la introducción de restricciones orientacionales.

Para medir los RDC es necesario que la molécula se oriente en un campo magnético. Para ello se recurre a diversos métodos que orientan las moléculas en solución; entre ellos podemos destacar: el uso de bicelas fosfolipídicas, fagos filamentosos, geles de poliacrilamida, fragmentos de membrana de bacterias como la membrana púrpura de Halobacterium salinarum y virus, así cómo también el uso de iones metálicos paramagnéticos (iones lantánidos). Otra opción es la alineación inducida por deformación de un gel.

Por ejemplo, para la determinación de acoplamientos dipolares 1DC,H se puede utilizar el experimento HSQC sin desacoplar en t2. En primer lugar se obtiene el espectro del compuesto en CDCl3 y luego en un medio que induzca una alineación parcial de la molécula (poli-g-bencil-L-glutamato). Por diferencia de los valores de acoplamiento entre un experimento y el otro se obtienen los 1DC,H.

Un ejemplo reciente de aplicación de esta técnica es la determinación de la estereoquímica de la Sagittamide A (J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15114-15115). Se trata de una molécula flexible con 6 centros quirales consecutivos (figura 2), y cuyas estereoquímicas relativas no puede determinarse solamente a partir de constantes de acoplamiento J y NOEs. Sin embargo, es posible lograr el objetivo si se combina esa información con datos de acoplamientos residuales dipolares H,C en varios medios de alineación.
Por último hay varios programas de acceso libre que permiten el análisis de RDCs a partir de los datos experimentales. Por ejemplo:

- Pales (de acceso libre: Linux, Windows y Mac): proteínas y moléculas orgánicas.
http://www.mpibpc.mpg.de/abteilungen/030/zweckstetter/_links/software_pales.htm)

- Module (de acceso libre: Mac, Linux y Unix ): proteínas
http://www.ibs.fr/ext/labos/LRMN/softs/

- MSpin (versión de prueba: Windows y Mac): moléculas orgánicas
http://www.mestrec.com/

En mi experiencia éste último es mucho más amigable para moléculas orgánicas. Además los módulos orientados a la determinación de NOEs y constantes de acoplamiento son los mejores que he probado hasta el momento. La desventaja obvia es que, más allá de la versión de prueba, no es de acceso libre.

Otro programa de mucha utilidad, y de acceso libre, es el Sparky, que permite realizar asignaciones y medir acoplamientos en espectros 2D:

- Sparky (Linux, Windows y Mac).
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/

Espero que el aporte les sea de utilidad.

Saludos,
Carolina
Muchas gracias Carolina
Versión en .pdf aquí

2 comentarios:

Diver dijo...

Muchas gracias por este completísimo aporte Carolina..te felicito

MAAZ dijo...

There is a site that has examples of aura camera systems at www.auracamera.com that prints aura photos. Has anyone experienced this system?

 

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