Levaduras como biocatalizadores en síntesis orgánica.

La biocatálisis en los últimos años ha adquirido un lugar destacado como “herramienta de la química orgánica sintética”. Si bien las fuentes de biocatalizadores son muy variadas, los microorganismos son una fuente muy rica y diversa de éstos, y el uso de microorganismos o enzimas microbianas como biocatalizadores es por lejos el más descrito en la literatura.
Desde el punto de vista de un químico sintético, es fundamental conocer para qué puede usarse un determinado biocatalizador –que posibilidades sintéticas nos ofrece-, por qué es mejor utilizar uno y no otro, y por supuesto, en qué forma se utiliza. Desde este enfoque y en relación a esos aspectos, quiero discutir algunas características de las levaduras.
Qué herramientas nos ofrecen las levaduras a los químicos orgánicos sintéticos?
Los objetivos sintéticos más destacados al pensar en levaduras como biocatalizadores, son la introducción de centros quirales, resolución de racematos, o la conversión selectiva de grupos funcionales en presencia de otros de similar reactividad química. Saccharomyces cerevisiae, es la levadura más utilizada en biocatálisis. Esto se debe además de a su disponibilidad y bajo costo, a que no necesita de medios de crecimiento estériles, siendo viable y sencillo trabajar con ella en un laboratorio no especializado en microbiología.
Los sistemas enzimáticos que se destacan en levaduras -desde el punto de vista de su utilidad sintética-, son: enzimas vinculadas a reacciones redox (deshidrogenasas, oxigenasas y oxidasas), enzimas hidrolíticas (lipasas, epóxido hidrolasas) y liasas que catalizan la formación de enlaces C-C.
De las enzimas redox, se presentarán solamente las deshidrogenasas, por ser enzimas muy versátiles y posiblemente las que tienen un manejo más sencillo para un químico orgánico sintético.
Deshidrogenasas:
Su utilidad en síntesis orgánica está vinculada a reacciones de desimetrización de compuestos proquirales, mediante reducción de grupos carbonilo de aldehídos y cetonas, y reducciones de dobles enlaces C=C. Las reacciones de oxidación enzimática no son un objetivo sintético valioso, ya que generalmente involucran la destrucción de centros quirales, y no poseen ventajas frente a las oxidaciones clásicas. En el caso de reducción de grupos carbonilo, las deshidrogenasas de levaduras se comportan mayormente de acuerdo a la regla de Prelog, por lo que se las relaciona con la preparación de alcoholes de configuración S.
La levadura de panificación (S. cerevisiae) es una potente herramienta para reducir selectivamente compuestos monocarbonílicos –aldehídos y cetonas- con sustituyentes alquilo o arilo, compuestos dicarbonílicos –a y b-dicetonas cíclicas y acíclicas, a y b-cetoésteres-, y obtener alcoholes secundarios de configuración S. Las cetonas estéricamente impedidas, no son en general sustratos, salvo las metilcetonas.
Un ejemplo que ilustra el potencial catalítico de las levaduras, es la preparación de inhibidores de la enzima que convierte el angiotensinógeno en angiotensina.1 Se utilizan células en reposo (resting cells) de S. cerevisiae y de Candida boidinii, para la obtención de los dos estereoisómeros de 2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. Ambos microorganismos ofrecen selectividades opuestas, obteniendo ambos enantiómeros con buenos rendimientos y ee.

Un aspecto interesante descrito para algunas deshidrogenasas de levaduras, es su capacidad de expandir el espectro de sustratos, en lo que se conoce como “promiscuidad enzimática”.2,3 Un ejemplo de este concepto, es una carbonil reductasa de C. parapsilosis, que reduce ariliminas a aminas secundarias aromáticas, logrando excesos enantioméricos de hasta el 99 % en el isómero R.3

Enzimas hidrolíticas:
Dentro de las enzimas hidrolíticas de levaduras, las lipasas ocupan una posición destacada en la preparación de una gran variedad de compuestos. Su utilización se lleva a cabo tanto con las células enteras del microorganismo (fermentación, resting cells), o las enzimas aisladas con diferente grado de purificación.
Las lipasas no necesitan cofactores, por lo que es sencillo utilizarlas como enzimas aisladas. El ser extracelulares facilita su purificación, y se dispone de una gran variedad de lipasas comerciales, producidas en gran escala y a bajo costo. Las principales levaduras productoras de lipasas pertenecen a los géneros Candida, Geotrichum, Trichosporon, Yarrowia y Kluyveromyces. Estas enzimas catalizan reacciones de hidrólisis, esterificación, transesterificación, alcohólisis, acidólisis, aminólisis, reacciones de Baeyer y Villiger, etc.
Las epóxido hidrolasas tienen un potencial sintético importante dado que catalizan la apertura de epóxidos en forma enantio y regioselectiva. No requieren de cofactores, y puede trabajarse con la enzima aislada o con el microorganismo entero. Las principales levaduras productoras de epóxido hidrolasas pertenecen a los géneros Rhodotorula y Rhodosporidium. Estas enzimas, aceptan una gran diversidad estructural de sustratos, incluso epóxidos estéricamente impedidos. Las enzimas aisladas trabajan bien en sistemas bifásicos, y en biotransformaciones con células enteras pueden utilizarse disolventes orgánicos. Epóxido hidrolasas de diferentes microorganismos, pueden tener enantio y/o regioselectividades complementarias, constituyendo una potente herramienta sintética.
Liasas:
La formación de enlaces C-C es un objetivo sintético fundamental para los químicos orgánicos sintéticos. En esto las liasas pueden darnos una mano. Un ejemplo de utilización del biocatalizador, y de manejo de las condiciones del proceso, es la producción de l-fenilacetilcarbinol (l-PAC), a través de una condensación aciloínica de benzaldehído y piruvato catalizada por S. cerevisiae como paso clave.4

El proceso tradicional,5 involucra la fermentación produciendo in situ piruvato a partir de glucosa. La descarboxilación de piruvato y la condensación con benzaldehído, son catalizadas por piruvato descarboxilasa. Con este procedimiento, el producto mayoritario es feniletanol, debido a la reducción del benzaldehído catalizada por alcohol deshidrogenasas de la levadura. La alternativa de inhibir estas enzimas que también participan en la glicólisis, tiene como consecuencia la necesidad de utilizar una fuente alternativa de piruvato. De este modo, y utilizando etanol como inhibidor de las deshidrogenasas, el proceso mejora sensiblemente su rendimiento.
Expandiendo el potencial catalítico de las levaduras.
La potencia de los procesos catalizados por levaduras como herramienta sintética no se ha puesto de manifiesto cabalmente aún. Para mejorar la selectividad de un proceso, suele no alcanzar con modificar el diseño de la reacción, el medio de cultivo o crecimiento del microorganismo, inmovilización, etc. Estas metodologías ayudan a mejorar los resultados, pero están basadas en la experiencia, dificultando la predicción a priori del comportamiento del experimento. Surge entonces la necesidad de un “diseño racional” del biocatalizador, que permita mejorar la eficiencia y selectividad de los procesos, de un modo predecible. El concepto de células de diseño -“designer cells”- ofrece a las levaduras, un potencial sintético inexplorado hasta la década de 1990, en que Stewart marca un punto de inflexión trabajando en la creación de cepas recombinantes de S. cerevisiae.6-8 La disponibilidad de esta levadura, el conocimiento de su genoma completo y de las enzimas involucradas en los procesos de interés, la convierten en un excelente campo sobre el que trabajar en este sentido.
Las herramientas genéticas que permiten manipular el nivel de expresión de una enzima en el microorganismo, son la sobreexpresión y bloqueo del gen que codifica para la enzima. La posibilidad de diseñar cepas mutantes que carezcan de enzimas competitivas de las involucradas en el proceso de interés, resulta en una importante mejora de la selectividad de la biotransformación.
Un lindo ejemplo de manipulación genética de S. cerevisiae para mejorar su selectividad en reducciones de β-cetoésteres fue descrito por S. Rodríguez y J. Stewart, y es la construcción de cepas en las que dos importantes ceto-reductasas son sobreexpresadas o bloqueadas alternativamente. El resultado fue la obtención de importantes mejoras en la estereoselectividad de los procesos.6

La sobreexpresión de la ciclohexanona monooxigenasa de Acinetobacter sp. NCIB 9871, en S. cerevisiae fue otro hito en cuanto a manipulación genética de levaduras,9-13 ya que la reacción de Baeyer y Villiger que la enzima cataliza tiene un enorme potencial en síntesis asimétrica. A partir del trabajo de Stewart en ésta área, este microorganismo de diseño puede convertirse para los químicos orgánicos, en un “reactivo”, equivalente sintético del perácido para la reacción de BV.
Espero que este pantallazo resulte útil, sobre todo en el sentido de permitirnos considerar cada día un espectro más amplio de herramientas para nuestra síntesis orgánica.

Saludos, Daniela

Referencias bibliográficas
(1) Chen, Y. et al. Adv. Syn. Catal. 2008, 350, 426-430. (2) Kratzer, R. et al. Chem. Comm. 2007, 10, 1047-1049. (3) Vaijayanthi, T. et al.Tetrahedron: Asymmetry 2008, 19, 93-96. (4) Kostraby, M. M. et al. Biotechnol. Bioeng. 2002, 77, 827-831. (5) Hilderbrandt, G. et al. U. S. Patent, 1934; Nº 1956950. (6) Rodríguez, S. et al. Org. Lett. 1999, 1, 1153-1155. (7) Rodríguez, S. et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1547-1555. (8) Kaluzna, I. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12827-12832. (9) Stewart, J. D. Curr. Opinion Biotechnol. 2000, 11, 363-368. (10) Stewart, J. D. et al. J. Chem. Soc. Perkin I 1996, 8, 755-757. (11) Stewart, J. D. et al. J. Org. Chem. 1996, 61, 7652-7653. (12) Stewart, J. D. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3541-3548. (13) Kayser, M. M. et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7103-7106.

Muchas gracias Daniela

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