Determinación de configuraciones relativas y/o absolutas por RMN

La determinación de configuraciones relativas y/o absolutas es uno de los aspectos más problemáticos en la elucidación estructural de compuestos orgánicos. En compuestos con propiedades conformacionales bien definidas, como sistemas rígidos, este estudio se puede hacer en forma rutinaria mediante experimentos de RMN de alta resolución. De esta forma, la determinación de las configuraciones relativas de compuestos cíclicos con anillos de tres a seis miembros, con varios centros quirales, puede ser llevada a cabo a partir de valores de constantes de acoplamiento protón-protón y/o mediante experimentos basados en el efecto nuclear Overhauser (NOE). Por otro lado, a pesar de que normalmente no se suelen emplear como rutina, las constantes de acoplamiento heteronucleares proporcionan información muy valiosa y pueden ser fácilmente determinadas a partir de experimentos HSQC o HMBC sin desacoplar.

Actualmente se pueden encontrar varias aplicaciones informáticas que permiten predecir NOEs y constantes de acoplamiento en forma teórica a partir de las estructuras químicas en 3D, o de un grupo de confórmeros. Por ejemplo, el programa MSpin (http://www.mestrec.com/) contiene varios módulos que permiten no solo la predicción de constantes de acoplamiento protón-protón, sino también la predicción de constantes de acoplamiento heteronucleares (varias de las cuales también están optimizadas para péptidos y glicósidos).

En el caso de sistemas flexibles, como cadenas carbonadas polisustituidas abiertas y compuestos macrocíclicos, la presencia de múltiples confórmeros hace que no se pueda aplicar la estrategia antes mencionada de forma directa, y por ende es necesario recurrir a otras alternativas. Algunos ejemplos que mencionaré a continuación son los métodos derivados de la técnica de Mosher y un método desarrollado más recientemente que se basa en el estudio de acoplamientos dipolares residuales.

Métodos basados en derivatización con agentes quirales (CDA):

Este es el método de elección para la asignación de configuraciones absolutas por RMN e involucra la derivatización del substrato (por ejemplo un enantiómero puro) con dos enantiómeros de un agente de derivatización quiral, dando lugar a dos diasterómeros.

El método de Mosher, implementado en 1973, utiliza MTPA (ácido metoxitriflurofenilacetico) como auxiliar quiral e involucra la comparación de dos espectros. La asignación de la configuración absoluta se basa en el uso de RMN para correlacionar la estereoquímica absoluta del centro quiral del agente auxiliar (de configuración conocida) con el del sustrato (configuración desconocida). Lo que se tiene en cuenta en este caso son los cambios en los desplazamientos químicos de los sustituyentes del carbono asimétrico del sustrato (L1 y L2) en los dos derivados. La diferencia de desplazamientos químicos tendrá signo opuesto en ambos sustituyentes, y dependerá de la estereoquímica absoluta del centro quiral del sustrato.

En general, la estructura de un auxiliar quiral debe incorporar grupos con funciones específicas:
- Un grupo polar o voluminoso para fijar una conformación particular.
- Un grupo funcional (por ej. ácido carboxílico) que dará lugar a la unión covalente con el sustrato.
- Un grupo que sea capaz de producir un efecto anisotrópico eficiente y orientado en el espacio (por ej. grupo aromático), que afecte selectivamente a los sustituyentes L1 y L2 del sustrato. Este apantallamiento / desapantallamiento asegura que los desplazamientos químicos de L1 y L2 sean diferentes en las dos especies (diasterómeros o confórmeros) que son utilizadas para la determinación de la conformación.

A través de los años se ha dado la evolución a reactivos mucho más eficientes, con posibilidades de ser utilizados en diferentes sustratos, y basados en el mismo principio (para mayor información ver Chem. Rev. 2004, 104, 17-117). Por otro lado, recientemente también han surgido métodos que solo requieren la preparación de un solo derivado. En este caso, se obtiene el espectro del derivado en las condiciones estándares y luego se induce un cambio conformacional en el derivado, para obtener el segundo espectro. Ésta modificación del equilibrio puede inducirse de dos maneras:

1) por reducción de la temperatura.
2) por quelación selectiva de uno de los confórmeros (por ej. utilizando sales de bario)

Acoplamiento residuales dipolares (RDCs):

Por último quería mencionar el método para la determinación de conformaciones y configuraciones de moléculas orgánicas mediante el estudio de acoplamientos residuales dipolares en diferentes medios de alineación. Esta es una técnica que se ha venido utilizando en RMN de proteínas, y recientemente se está empezando a aplicar con éxito en moléculas orgánicas. Solo se ha vuelto accesible a moléculas orgánicas muy recientemente, debido a la disponibilidad de medios de alineación compatibles con solventes orgánicos. (J. Magn. Res. 2003, 163, 353-359)

Esta metodología se basa en la obtención de pequeños grados de alineación de las moléculas en el campo magnético. El alineamiento molecular parcial conduce a un promedio incompleto de las interacciones dipolo-dipolo, dando lugar a acoplamientos dipolares D, que se miden en forma análoga a las constantes de acoplamiento J. Estos acoplamientos permiten agregar información a la determinación estructural, a través de la introducción de restricciones orientacionales.

Para medir los RDC es necesario que la molécula se oriente en un campo magnético. Para ello se recurre a diversos métodos que orientan las moléculas en solución; entre ellos podemos destacar: el uso de bicelas fosfolipídicas, fagos filamentosos, geles de poliacrilamida, fragmentos de membrana de bacterias como la membrana púrpura de Halobacterium salinarum y virus, así cómo también el uso de iones metálicos paramagnéticos (iones lantánidos). Otra opción es la alineación inducida por deformación de un gel.

Por ejemplo, para la determinación de acoplamientos dipolares 1DC,H se puede utilizar el experimento HSQC sin desacoplar en t2. En primer lugar se obtiene el espectro del compuesto en CDCl3 y luego en un medio que induzca una alineación parcial de la molécula (poli-g-bencil-L-glutamato). Por diferencia de los valores de acoplamiento entre un experimento y el otro se obtienen los 1DC,H.

Un ejemplo reciente de aplicación de esta técnica es la determinación de la estereoquímica de la Sagittamide A (J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15114-15115). Se trata de una molécula flexible con 6 centros quirales consecutivos (figura 2), y cuyas estereoquímicas relativas no puede determinarse solamente a partir de constantes de acoplamiento J y NOEs. Sin embargo, es posible lograr el objetivo si se combina esa información con datos de acoplamientos residuales dipolares H,C en varios medios de alineación.

Por último hay varios programas de acceso libre que permiten el análisis de RDCs a partir de los datos experimentales. Por ejemplo:

- Pales (de acceso libre: Linux, Windows y Mac): proteínas y moléculas orgánicas.
http://www.mpibpc.mpg.de/abteilungen/030/zweckstetter/_links/software_pales.htm)

- Module (de acceso libre: Mac, Linux y Unix ): proteínas
http://www.ibs.fr/ext/labos/LRMN/softs/

- MSpin (versión de prueba: Windows y Mac): moléculas orgánicas
http://www.mestrec.com/

En mi experiencia éste último es mucho más amigable para moléculas orgánicas. Además los módulos orientados a la determinación de NOEs y constantes de acoplamiento son los mejores que he probado hasta el momento. La desventaja obvia es que, más allá de la versión de prueba, no es de acceso libre.

Otro programa de mucha utilidad, y de acceso libre, es el Sparky, que permite realizar asignaciones y medir acoplamientos en espectros 2D:

- Sparky (Linux, Windows y Mac).
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/

Espero que el aporte les sea de utilidad.

Saludos,
Carolina

Muchas gracias Carolina

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Levaduras como biocatalizadores en síntesis orgánica.

La biocatálisis en los últimos años ha adquirido un lugar destacado como “herramienta de la química orgánica sintética”. Si bien las fuentes de biocatalizadores son muy variadas, los microorganismos son una fuente muy rica y diversa de éstos, y el uso de microorganismos o enzimas microbianas como biocatalizadores es por lejos el más descrito en la literatura.
Desde el punto de vista de un químico sintético, es fundamental conocer para qué puede usarse un determinado biocatalizador –que posibilidades sintéticas nos ofrece-, por qué es mejor utilizar uno y no otro, y por supuesto, en qué forma se utiliza. Desde este enfoque y en relación a esos aspectos, quiero discutir algunas características de las levaduras.
Qué herramientas nos ofrecen las levaduras a los químicos orgánicos sintéticos?
Los objetivos sintéticos más destacados al pensar en levaduras como biocatalizadores, son la introducción de centros quirales, resolución de racematos, o la conversión selectiva de grupos funcionales en presencia de otros de similar reactividad química. Saccharomyces cerevisiae, es la levadura más utilizada en biocatálisis. Esto se debe además de a su disponibilidad y bajo costo, a que no necesita de medios de crecimiento estériles, siendo viable y sencillo trabajar con ella en un laboratorio no especializado en microbiología.
Los sistemas enzimáticos que se destacan en levaduras -desde el punto de vista de su utilidad sintética-, son: enzimas vinculadas a reacciones redox (deshidrogenasas, oxigenasas y oxidasas), enzimas hidrolíticas (lipasas, epóxido hidrolasas) y liasas que catalizan la formación de enlaces C-C.
De las enzimas redox, se presentarán solamente las deshidrogenasas, por ser enzimas muy versátiles y posiblemente las que tienen un manejo más sencillo para un químico orgánico sintético.
Deshidrogenasas:
Su utilidad en síntesis orgánica está vinculada a reacciones de desimetrización de compuestos proquirales, mediante reducción de grupos carbonilo de aldehídos y cetonas, y reducciones de dobles enlaces C=C. Las reacciones de oxidación enzimática no son un objetivo sintético valioso, ya que generalmente involucran la destrucción de centros quirales, y no poseen ventajas frente a las oxidaciones clásicas. En el caso de reducción de grupos carbonilo, las deshidrogenasas de levaduras se comportan mayormente de acuerdo a la regla de Prelog, por lo que se las relaciona con la preparación de alcoholes de configuración S.
La levadura de panificación (S. cerevisiae) es una potente herramienta para reducir selectivamente compuestos monocarbonílicos –aldehídos y cetonas- con sustituyentes alquilo o arilo, compuestos dicarbonílicos –a y b-dicetonas cíclicas y acíclicas, a y b-cetoésteres-, y obtener alcoholes secundarios de configuración S. Las cetonas estéricamente impedidas, no son en general sustratos, salvo las metilcetonas.
Un ejemplo que ilustra el potencial catalítico de las levaduras, es la preparación de inhibidores de la enzima que convierte el angiotensinógeno en angiotensina.1 Se utilizan células en reposo (resting cells) de S. cerevisiae y de Candida boidinii, para la obtención de los dos estereoisómeros de 2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo. Ambos microorganismos ofrecen selectividades opuestas, obteniendo ambos enantiómeros con buenos rendimientos y ee.

Un aspecto interesante descrito para algunas deshidrogenasas de levaduras, es su capacidad de expandir el espectro de sustratos, en lo que se conoce como “promiscuidad enzimática”.2,3 Un ejemplo de este concepto, es una carbonil reductasa de C. parapsilosis, que reduce ariliminas a aminas secundarias aromáticas, logrando excesos enantioméricos de hasta el 99 % en el isómero R.3

Enzimas hidrolíticas:
Dentro de las enzimas hidrolíticas de levaduras, las lipasas ocupan una posición destacada en la preparación de una gran variedad de compuestos. Su utilización se lleva a cabo tanto con las células enteras del microorganismo (fermentación, resting cells), o las enzimas aisladas con diferente grado de purificación.
Las lipasas no necesitan cofactores, por lo que es sencillo utilizarlas como enzimas aisladas. El ser extracelulares facilita su purificación, y se dispone de una gran variedad de lipasas comerciales, producidas en gran escala y a bajo costo. Las principales levaduras productoras de lipasas pertenecen a los géneros Candida, Geotrichum, Trichosporon, Yarrowia y Kluyveromyces. Estas enzimas catalizan reacciones de hidrólisis, esterificación, transesterificación, alcohólisis, acidólisis, aminólisis, reacciones de Baeyer y Villiger, etc.
Las epóxido hidrolasas tienen un potencial sintético importante dado que catalizan la apertura de epóxidos en forma enantio y regioselectiva. No requieren de cofactores, y puede trabajarse con la enzima aislada o con el microorganismo entero. Las principales levaduras productoras de epóxido hidrolasas pertenecen a los géneros Rhodotorula y Rhodosporidium. Estas enzimas, aceptan una gran diversidad estructural de sustratos, incluso epóxidos estéricamente impedidos. Las enzimas aisladas trabajan bien en sistemas bifásicos, y en biotransformaciones con células enteras pueden utilizarse disolventes orgánicos. Epóxido hidrolasas de diferentes microorganismos, pueden tener enantio y/o regioselectividades complementarias, constituyendo una potente herramienta sintética.
Liasas:
La formación de enlaces C-C es un objetivo sintético fundamental para los químicos orgánicos sintéticos. En esto las liasas pueden darnos una mano. Un ejemplo de utilización del biocatalizador, y de manejo de las condiciones del proceso, es la producción de l-fenilacetilcarbinol (l-PAC), a través de una condensación aciloínica de benzaldehído y piruvato catalizada por S. cerevisiae como paso clave.4

El proceso tradicional,5 involucra la fermentación produciendo in situ piruvato a partir de glucosa. La descarboxilación de piruvato y la condensación con benzaldehído, son catalizadas por piruvato descarboxilasa. Con este procedimiento, el producto mayoritario es feniletanol, debido a la reducción del benzaldehído catalizada por alcohol deshidrogenasas de la levadura. La alternativa de inhibir estas enzimas que también participan en la glicólisis, tiene como consecuencia la necesidad de utilizar una fuente alternativa de piruvato. De este modo, y utilizando etanol como inhibidor de las deshidrogenasas, el proceso mejora sensiblemente su rendimiento.
Expandiendo el potencial catalítico de las levaduras.
La potencia de los procesos catalizados por levaduras como herramienta sintética no se ha puesto de manifiesto cabalmente aún. Para mejorar la selectividad de un proceso, suele no alcanzar con modificar el diseño de la reacción, el medio de cultivo o crecimiento del microorganismo, inmovilización, etc. Estas metodologías ayudan a mejorar los resultados, pero están basadas en la experiencia, dificultando la predicción a priori del comportamiento del experimento. Surge entonces la necesidad de un “diseño racional” del biocatalizador, que permita mejorar la eficiencia y selectividad de los procesos, de un modo predecible. El concepto de células de diseño -“designer cells”- ofrece a las levaduras, un potencial sintético inexplorado hasta la década de 1990, en que Stewart marca un punto de inflexión trabajando en la creación de cepas recombinantes de S. cerevisiae.6-8 La disponibilidad de esta levadura, el conocimiento de su genoma completo y de las enzimas involucradas en los procesos de interés, la convierten en un excelente campo sobre el que trabajar en este sentido.
Las herramientas genéticas que permiten manipular el nivel de expresión de una enzima en el microorganismo, son la sobreexpresión y bloqueo del gen que codifica para la enzima. La posibilidad de diseñar cepas mutantes que carezcan de enzimas competitivas de las involucradas en el proceso de interés, resulta en una importante mejora de la selectividad de la biotransformación.
Un lindo ejemplo de manipulación genética de S. cerevisiae para mejorar su selectividad en reducciones de β-cetoésteres fue descrito por S. Rodríguez y J. Stewart, y es la construcción de cepas en las que dos importantes ceto-reductasas son sobreexpresadas o bloqueadas alternativamente. El resultado fue la obtención de importantes mejoras en la estereoselectividad de los procesos.6

La sobreexpresión de la ciclohexanona monooxigenasa de Acinetobacter sp. NCIB 9871, en S. cerevisiae fue otro hito en cuanto a manipulación genética de levaduras,9-13 ya que la reacción de Baeyer y Villiger que la enzima cataliza tiene un enorme potencial en síntesis asimétrica. A partir del trabajo de Stewart en ésta área, este microorganismo de diseño puede convertirse para los químicos orgánicos, en un “reactivo”, equivalente sintético del perácido para la reacción de BV.
Espero que este pantallazo resulte útil, sobre todo en el sentido de permitirnos considerar cada día un espectro más amplio de herramientas para nuestra síntesis orgánica.

Saludos, Daniela

Referencias bibliográficas
(1) Chen, Y. et al. Adv. Syn. Catal. 2008, 350, 426-430. (2) Kratzer, R. et al. Chem. Comm. 2007, 10, 1047-1049. (3) Vaijayanthi, T. et al.Tetrahedron: Asymmetry 2008, 19, 93-96. (4) Kostraby, M. M. et al. Biotechnol. Bioeng. 2002, 77, 827-831. (5) Hilderbrandt, G. et al. U. S. Patent, 1934; Nº 1956950. (6) Rodríguez, S. et al. Org. Lett. 1999, 1, 1153-1155. (7) Rodríguez, S. et al. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1547-1555. (8) Kaluzna, I. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12827-12832. (9) Stewart, J. D. Curr. Opinion Biotechnol. 2000, 11, 363-368. (10) Stewart, J. D. et al. J. Chem. Soc. Perkin I 1996, 8, 755-757. (11) Stewart, J. D. et al. J. Org. Chem. 1996, 61, 7652-7653. (12) Stewart, J. D. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3541-3548. (13) Kayser, M. M. et al. J. Org. Chem. 1998, 63, 7103-7106.

Muchas gracias Daniela

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Acerca de la espectrometría de masas

La espectrometría de masas es una herramienta fundamental para los químicos orgánicos en el campo de la determinación estructural y el análisis. La evolución en esta técnica ha sido tan rápida que a muchos orgánicos nos cuesta estar al tanto de los cambios. Por eso ante la invitación a participar en este blog se me ha ocurrido plantear algunas cuestiones relacionadas a como encarar los análisis de las muestras de nuestros productos de síntesis para obtener espectroscopía de MS.
El primer concepto que tenemos que tener claro de la espectroscopía de masas es que para obtener un espectro de cualquier producto este tiene que llevarse al estado de ión en fase gaseosa. En los equipos que hacen ionización por impacto electrónico el compuesto se volatiliza y luego se ioniza por una descarga de electrones. Entonces los compuestos que pueden ionizarse son aquellos que son volátiles. Pero el concepto de volátil es mucho más amplio que el que intuitivamente tenemos.
El MS trabaja a un vacío del orden de 10-6 torr. Cuando se hace una introducción directa de la muestra, sea sólida o líquida, esta se incorpora en un microcapilar dentro de la celda de ionización y se calienta. Al ser calentada en el vacío la muestra pasará a gas y en ese momento se ionizará. Entonces para hacer masa de DI-EI-MS compuestos “volátiles” son aquellas sustancias con pesos moleculares inferiores a 900-1000 Uma y tengan una polaridad media a baja. Generalmente no pueden ser sales ni polioles como azúcares sin derivatizar.
Si en lugar de Inyección directa queremos usar GC-MS, la muestra tendrá que pasar por el inyector que la volatilizará a 250 ºC pero a presión atmosférica y luego deberá pasar por la columna cromatográfica cuya temperatura se varía para eluir el compuesto pero que generalmente no puede superar los 300ºC. Por lo tanto aquí “volátil” abarca un rango menor de moléculas puesto que estas deben poder pasar a gas en estas condiciones sin descomponerse. Generalmente son moléculas de tamaño menor a unos 500 uma y de polaridad aún más baja.
Ahora nos encontramos ante el surgimiento de los LCMS con sistemas de ionización a presión atmosférica que han cambiado profundamente la situación.
El ESI, electro-spray ionization es un sistema que utiliza la ionización existente en un medio acuoso para formar una niebla y los iones se van desolvatando mediante la acción combinada de un gas caliente y la propia concentración de cargas. Los compuestos que no están en forma iónica pueden igualmente ionizarse por ionización química donde el medio acuoso o el solvente actúan como gas reactivo. En estas condiciones lo volátil del analito ya no importa y cualquier sustancia soluble puede ionizarse. La restricción será que tenga la polaridad necesaria para protonarse en estas condiciones.
En resumen hoy en día cuando pensamos en que espectroscopía de masa hacerle a nuestro producto debemos en primer lugar ver como es la molécula y preguntarnos sobre su “volatilidad”. Es la pregunta esencial de todo analista, ¿por GC o HPLC?

Conjuntamente con los cambios en métodos de ionización se producen cambios en la información obtenida por la espectroscopía de masas.
En la ionización por impacto electrónico estamos sometiendo a las moléculas a una descarga de electrones con una elevada energía (70 o 20 EV), por lo que los iones formados son inestables y se fragmentan por un montón de mecanismos posibles. El espectro típico de impacto electrónico tiene un gran número de fragmentos iónicos y generalmente un pico de ión molecular pequeño. Esto es beneficioso porque los químicos hemos aprendido a interpretar esta información para determinar las estructuras, o a guardarlas en bibliotecas para comparación.
En el ESI la iónización es muy blanda, los iones, cuando se forman son generalmente aductos de M+ H y si la inyección fue directa de M + Na , M+K, que se conocen como iones pseudo moleculares. Lo que generalmente no vemos en el espectro son los queridos fragmentos del ión molecular del impacto electrónico. Otros iones que podemos ver en el ESI son iones polivalentes cuando la molécula puede acomodar 2 o más cargas como los péptido o aminoácidos. Tendremos iones de m/z = (M+2H)/2, ( M + 2 Na)/2, etc. En ese caso se observará un patrón isotópico con separación de carga distinto al m+1, m+2 típico. Entonces en el espectro del producto tendremos su pseudo ión molecular, con su patrón isotópico que nos puede indicar la presencia de cloro o bromo, y iones polivalentes. Los otros iones del espectro generalmente mostrarán las impurezas contenidas en la muestra.
Parece poco pero puede ser suficiente en la mayoría de los casos que se cuenta con una buena espectroscopía de NMR.
En caso de ser necesario, hay otros plus que se pueden usar.
Los sistemas que permiten hacer MS/MS, como en el caso de la trampa iónica, toman un ión seleccionado, el pseudo-molecular u otro, y lo someten a fragmentación por impacto con un gas inerte, y luego analizan esa fragmentación. Esto permite establecer una relación de iones padres e hijos que dan información estructural importante en el caso de tener que diferenciar isómeros, ciclos, posiciones de sustituyentes, etc.
Otros equipos, como los QTof, utilizan la alta resolución de separación de iones y la exactitud en la determinación de la masa para darnos una fórmula molecular del compuesto, basada en la masa exacta del ión y de sus isotopómeros. Estos equipos de HR-LC-MS son más sofisticados y necesitan de una calibración permanente para poder dar esa exactitud. Cuanto mayor sea esa exactitud, menor será la cantidad de posibles fórmulas para el compuesto. Con una exactitud de 5 ppm para una molécula de 250 uma habrá muy pocas fórmulas pero para una de 500 pueden llegar a ser decenas. Para llegar a hacer masas de alta es conveniente que sepamos que: 1º el producto está puro y 2º el producto ioniza en el ESI o sea ya que haya analizado en un equipo de LCMS de baja resolución.

Espero que estas orientaciones les sirvan y que nos manden sus experiencias para que podamos conocer y manejar mejor esta, para nosotros, nueva herramienta.



Saludos Danilo



Gracias ]Danilo por tu aporte Leer más...

Dihidroxilación Asimétrica de Sharpless

Debido a la creciente necesidad de desarrollar síntesis eficientes de compuestos biológicamente activos en su forma enantioméricamente pura, en la última década han surgido un número considerable de reacciones de inducción asimétrica entre las que se encuentra la dihidroxilación asimétrica de Sharpless.^1,2

Hoy quiero hacer un aporte al blog, basado en mi humilde experiencia en “dihidroxilaciones asimétricas de Sharpless” (DHAS); una metodología fácil, rápida y sencilla para obtener cis-dioles vecinales en forma enantioselectiva a partir de olefinas proquirales. Metodología que presenta para algunas olefinas “consideraciones” importantes a la hora de llevar a cabo la reacción y su work-up. Consideraciones que mejoran sustancialmente el rendimiento de la reacción.

El artículo “Catalytic Asymmetric Dihidroxylation” de Sharpless, Chem. Rev. 1994, 94, 2483-2547; a pesar de haberse reportado hace mas de diez años, está aún vigente. Dicho artículo explica detalladamente los diferentes aspectos y condiciones a tener en cuenta en este tipo de reacciones; por lo que aquí presentaré un pequeñísimo resumen de algunos conceptos importantes a tener presente cuando se llevan a cabo estas reacciones.

Hoy en día la mayoría de las DHAS, en condiciones catalíticas, de llevan a cabo utilizando como reactivo osmilante los complejos AD-mix-alfa ó AD-mix-beta. Estos reactivos osmilantes solo se diferencian en las aminas quirales que utilizan como ligandos; es así que:

• 1.4g de AD-mix-alfa contiene: K₃Fe(CN)₆ (3mmol), K₂CO₃ (3mmol), K₂OsO₂(OH)₄ (0.002mmol) y (DHQ)₂-PHAL (0.01 mmol).



• 1.4g de AD-mix-beta contiene: K₃Fe(CN)₆ (3mmol), K₂CO₃ (3mmol), K₂OsO₂(OH)₄ (0.002mmol) y (DHQD)₂-PHAL (0.01 mmol),

donde DHQ son ligandos derivados de dihidroquinina, DHQD ligandos derivados de dihidroquinidina y PHAL ftalacina.¹

Cada uno de estos reactivos cumple una función diferente:

1. K₂OsO₂(OH)₄ es la fuente de OsO₄ (0.002mmol) catalítico

2. K₃Fe(CN)₆ es el reoxidante

3. K₂CO₃ genera las condiciones básicas necesarias (pH~12 en capa acuosa) para que se de la hidrólisis del intermedio osmato-ester. Condiciones de pH importantes cuando se utilizan olefinas impedidas.³
   

4. (DHQ)₂-PHAL y (DHQD)₂-PHAL ligandos quirales.

La reacción es heterogénea y se lleva a cabo en H₂O:t-BuOH (1:1), se ha visto que el uso de disolventes menos polares se traduce en la obtención de productos con menor enantioselectividad. La concentración de la olefina en la mezcla de reacción debe ser de aprox. 0.1M. Y el mecanismo de la reacción se da a través de dos ciclos catalíticos uno en la fase orgánica y otro en la fase acuosa, siendo el OsO₄ el único oxidante presente en la fase orgánica.

Esquema. Ciclo catalítico

La hidrólisis del éster de osmio (VI) se acelera considerablemente en presencia de metanosulfonamida (CH₃SO₂NH₃). Al añadir este aditivo los tiempos de reacción pueden llegar a ser hasta 50 veces más cortos.² Debido al efecto de la metanosulfonamida, la mayoría de las reacciones pueden llevarse a cabo en un rango de temperatura entre 0ºC y temperatura ambiente, lo cual suele influir beneficiosamente en cuanto a la selectividad se refiere.⁴ De manera general, se añade un equivalente a la mezcla de reacción,⁵ excepto para olefinas terminales. Las olefinas monosustituidas y las 1,1-disustituidas reaccionan de manera más lenta en presencia de metanosulfonamida.

La elección del complejo AD-mix-alfa o beta, está determinada por las configuraciones finales deseadas en los carbonos del cis-diol, lo que a su vez determina la selectividad pi facial del ataque al doble enlace. Existe un dispositivo nemotécnico empírico a través del cual se racionaliza la selectividad enantiofacial del ataque en estas reacciones. El mismo permite predecir el diastereómero predominante a obtener en la reacción, el cual presentará una configuración absoluta consistente con el dispositivo nemotécnico desarrollado. Este dispositivo ubica al doble enlace en un plano y a sus sustituyentes en los cuatro cuadrantes del plano, a los que llama: SE (sur este), SO (sur oeste), NE (noreste) y NO (noroeste). Los cuadrante SE y NO presentan barreras estéricas por lo que en esos cuadrante deben ubicarse los sustituyentes pequeños del doble enlace (H, Rs). También se ha visto empíricamente que la posición NO es preferencial para alcoholes alílicos, homoalílicos y grupos alcóxido. El cuadrante SO es atractivo para acomodar grupos voluminosos ó planos y se ha visto que sustituyentes oxigenados presentan muy baja tendencia a ocupar ese lugar. La figura muestra este dispositivo nemotécnico. Entonces, una olefina dispuesta según estas limitaciones será atacada por la cara superior del plano, cara beta cuando se utiliza AD-mix-beta.; ó por la cara inferior del plano, cara alfa, cuando se utiliza AD-mix-alfa.^1,6

Figura . Racionalización de la selectividad enantiofacial en las reacciones de DHAS, dispositivo nemotécnico empírico.

Las olefinas 1,1-disustituidas, las trans-1,2-disustituidas, así como las trisustituidas pueden ser consideradas como sustratos estándares para la dihidroxilación asimétrica, cumpliéndose la regla nemotécnica. En cambio se ha visto que las olefinas cis-disustituídas no siempre dan alta enentioselectividad en los productos finales.

• Procedimiento general para la dihidroxilación de 1mmol de olefina con AD-mix:

(Técnica pág. 2495, Chem. Rev. 1994, 94, 2483)

(Si bien la técnica puede encontrarse en más de un artículo, me pareció importante incorporarla ya que me gustaría precisar algunos aspectos experimentales que no siempre están descritos en las técnicas y creo son importantes ha tener en cuenta.)

En un balón de 25 mL se mezclan a T.A. y con agitación 5 mL de t-BuOH, 5 mL de H₂O y 1.4 g de AD-mix alfa ó beta.^(a) Si la olefina es 1,2-disustituída, trisustituída y tetrasustituída, debe adicionarse además 1 eq. de MeSO₂NH₂.^(b) La mezcla se agita a T.A. hasta que ambas fases quedan límpidas y luego se lleva a 0^oC.^(c) Se adiciona 1mmol de la olefina ^(d) y la mezcla heterogénea se mantiene a 0^oC con agitación vigorosa.^(e) Finalizada la reacción ^(f) la misma se quenchea a 0^oC con solución acuosa saturada de sulfito de sodio (1,5g/ mmol de olefina) y se deja llegar a T.A. con agitación durante 30 a 60 minutos.^(g) La mezcla de reacción se extrae varias veces con AcOEt ó CH₂Cl₂.^(h) Si se ha utilizado MeSO₂NH₂, la fase orgánica se lava con KOH 2N.⁽ⁱ⁾ Las fases orgánicas se secan y se rotaevapora el disolvente.

• Consideraciones experimentales importantes:

1. El complejo AD-mix alfa y beta es un polvo naranja-rojizo, espeso y denso. A temperatura ambiente y en la mezcla de reacción t-BuOH:H₂O (1:1), se logra la total disolución del mismo con importante agitación, formándose una solución naranja-amarillenta límpida.
2. La metanosulfonamida es un sólido cristalino blanco (muy higroscópico), muy soluble en la mezcla de reacción, por lo que al adicionarlo al sistema a T.A. se disuelve fácilmente.
3. Cuando la solución se lleva a 0^oC comienzan a precipitar sales del complejo. Aquí la agitación del sistema es clave, ya que la reacción es heterogénea y recordemos que el ciclo catalítico presenta dos fases; una orgánica en la cual se lleva a cabo la osmilación con el OsO₄ y otra acuso donde el OsO₄ es generado y regenerado.
4. Existen artículos que plantean la adición de la olefina de una sola vez, mi experiencia me ha mostrado que la adición gota a gota de la olefina al sistema da mejores resultados.
5. A medida que la reacción avanza, la solución y los sólidos presentes en ella van tomando un tinte más amarillento y menos naranja.
6. Esta etapa de quencheo se realiza utilizando una solución saturada de Na₂S₂O₃ (se utiliza un volumen de solución de 2/3 el volumen de la mezcla de reacción), la adición se hace de una sola vez con importante agitación a 0^oC y se deja agitando a esa temperatura por unos minutos. Luego la solución se deja llegar a T.A. con agitación durante 30 a 60 minutos. Aquí se logra la disolución total de las sales del complejo. Finalmente la mezcla de reacción queda límpida, la misma va cambiando de color (de amarillo a verdoso), a medida que se van disolviendo las sales.
7. Finalizada la disolución de las sales , se llevan a cabo las extracciones con AcOEt ó CH₂Cl₂.
8. Existen diferentes formas de eliminar la metanosulfonamida en caso de haber sido utilizada. La eliminación de la misma de la fase orgánica es calve para tener un buen rendimiento final en el crudo de reacción. La que yo utilicé no es exactamente la reportada en esta técnica por lo que paso a describirla:

Luego de la etapa de extracción, secado de las fases orgánicas y eliminación del disolvente, el crudo de reacción se toma en la “mínima” cantidad de CH₂Cl₂ posible (debe quedar una disolución no muy diluida, ni un aceite) y se le adiciona de a poco por las paredes del recipiente hexano (como si se realizara una recristalización con dos disolventes). A medida que se adiciona hexano se observa la formación de un aceite lechoso, el cual se va transformándo en pequeños cristales blancos. La adición debe realizarse lentamente, con paciencia y dejando reposar el sistema para darle tiempo a la formación de cristales de metanosulfonamida. Este procedimiento se continúa hasta que no se observa la formación de precipitado con el agregado de hexano.

La metanosulfonamida cristalizada se filtra a vacío y se rotaevapora el sobrenadante, conteniendo allí el producto final deseado, libre de metanosulfonamida.

El haber ensayado esta reacción con diversos sustratos, me ha permitido compartir con ustedes los datos experimentales que he descrito.

A lo mejor en sus caminos sintéticos no necesiten de una DHAS, pero en caso de necesitarla, espero le sean útiles los consejos aquí vertidos. Suerte con la reacción......

1. Kolb, H. C.; VanNieuwenhze, M. S.; Sharpless, K. B. Chem. Rev. 1994, 94, 2483.
2. (a) Johnson, R. A.; Sharpless, K. B. Catalytic Asymmetric Dihydroxylation. En Catalytic Asymmetric Synthesis; Ojima, I., Ed.; VCH Publishers: New York, 1993; pp 227-272. (b) Lohray, B. B. Tetrahedron:Asymmetry 1992, 3, 1317.
3. Mehltretter, G.M.; Döbler, C.; Sundermeier, U.; Beller, M. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 8083.
4. Göbel, T.; Sharpless, K. B. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1993, 32, 1329.
5. (a) Sharpless, K. B.; Amberg, W.; Bennani, Y. L.; Crispino, G. A.; Hartung, J.; Jeong, K-S.; Kwong, H.-L.; Morikawa, K.; Wang, Z.-M.; Xu, D.; Zhang, X.-L. J. Org. Chem. 1992, 57, 2768.
6. Wang, L.; Sharpless, B. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 7568-7570.

Saludos Margarita

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