jueves, 4 de diciembre de 2008

Acerca de la espectrometría de masas

La espectrometría de masas es una herramienta fundamental para los químicos orgánicos en el campo de la determinación estructural y el análisis. La evolución en esta técnica ha sido tan rápida que a muchos orgánicos nos cuesta estar al tanto de los cambios. Por eso ante la invitación a participar en este blog se me ha ocurrido plantear algunas cuestiones relacionadas a como encarar los análisis de las muestras de nuestros productos de síntesis para obtener espectroscopía de MS.
El primer concepto que tenemos que tener claro de la espectroscopía de masas es que para obtener un espectro de cualquier producto este tiene que llevarse al estado de ión en fase gaseosa. En los equipos que hacen ionización por impacto electrónico el compuesto se volatiliza y luego se ioniza por una descarga de electrones. Entonces los compuestos que pueden ionizarse son aquellos que son volátiles. Pero el concepto de volátil es mucho más amplio que el que intuitivamente tenemos.
El MS trabaja a un vacío del orden de 10-6 torr. Cuando se hace una introducción directa de la muestra, sea sólida o líquida, esta se incorpora en un microcapilar dentro de la celda de ionización y se calienta. Al ser calentada en el vacío la muestra pasará a gas y en ese momento se ionizará. Entonces para hacer masa de DI-EI-MS compuestos “volátiles” son aquellas sustancias con pesos moleculares inferiores a 900-1000 Uma y tengan una polaridad media a baja. Generalmente no pueden ser sales ni polioles como azúcares sin derivatizar.
Si en lugar de Inyección directa queremos usar GC-MS, la muestra tendrá que pasar por el inyector que la volatilizará a 250 ºC pero a presión atmosférica y luego deberá pasar por la columna cromatográfica cuya temperatura se varía para eluir el compuesto pero que generalmente no puede superar los 300ºC. Por lo tanto aquí “volátil” abarca un rango menor de moléculas puesto que estas deben poder pasar a gas en estas condiciones sin descomponerse. Generalmente son moléculas de tamaño menor a unos 500 uma y de polaridad aún más baja.
Ahora nos encontramos ante el surgimiento de los LCMS con sistemas de ionización a presión atmosférica que han cambiado profundamente la situación.
El ESI, electro-spray ionization es un sistema que utiliza la ionización existente en un medio acuoso para formar una niebla y los iones se van desolvatando mediante la acción combinada de un gas caliente y la propia concentración de cargas. Los compuestos que no están en forma iónica pueden igualmente ionizarse por ionización química donde el medio acuoso o el solvente actúan como gas reactivo. En estas condiciones lo volátil del analito ya no importa y cualquier sustancia soluble puede ionizarse. La restricción será que tenga la polaridad necesaria para protonarse en estas condiciones.
En resumen hoy en día cuando pensamos en que espectroscopía de masa hacerle a nuestro producto debemos en primer lugar ver como es la molécula y preguntarnos sobre su “volatilidad”. Es la pregunta esencial de todo analista, ¿por GC o HPLC?

Conjuntamente con los cambios en métodos de ionización se producen cambios en la información obtenida por la espectroscopía de masas.
En la ionización por impacto electrónico estamos sometiendo a las moléculas a una descarga de electrones con una elevada energía (70 o 20 EV), por lo que los iones formados son inestables y se fragmentan por un montón de mecanismos posibles. El espectro típico de impacto electrónico tiene un gran número de fragmentos iónicos y generalmente un pico de ión molecular pequeño. Esto es beneficioso porque los químicos hemos aprendido a interpretar esta información para determinar las estructuras, o a guardarlas en bibliotecas para comparación.
En el ESI la iónización es muy blanda, los iones, cuando se forman son generalmente aductos de M+ H y si la inyección fue directa de M + Na , M+K, que se conocen como iones pseudo moleculares. Lo que generalmente no vemos en el espectro son los queridos fragmentos del ión molecular del impacto electrónico. Otros iones que podemos ver en el ESI son iones polivalentes cuando la molécula puede acomodar 2 o más cargas como los péptido o aminoácidos. Tendremos iones de m/z = (M+2H)/2, ( M + 2 Na)/2, etc. En ese caso se observará un patrón isotópico con separación de carga distinto al m+1, m+2 típico. Entonces en el espectro del producto tendremos su pseudo ión molecular, con su patrón isotópico que nos puede indicar la presencia de cloro o bromo, y iones polivalentes. Los otros iones del espectro generalmente mostrarán las impurezas contenidas en la muestra.
Parece poco pero puede ser suficiente en la mayoría de los casos que se cuenta con una buena espectroscopía de NMR.
En caso de ser necesario, hay otros plus que se pueden usar.
Los sistemas que permiten hacer MS/MS, como en el caso de la trampa iónica, toman un ión seleccionado, el pseudo-molecular u otro, y lo someten a fragmentación por impacto con un gas inerte, y luego analizan esa fragmentación. Esto permite establecer una relación de iones padres e hijos que dan información estructural importante en el caso de tener que diferenciar isómeros, ciclos, posiciones de sustituyentes, etc.
Otros equipos, como los QTof, utilizan la alta resolución de separación de iones y la exactitud en la determinación de la masa para darnos una fórmula molecular del compuesto, basada en la masa exacta del ión y de sus isotopómeros. Estos equipos de HR-LC-MS son más sofisticados y necesitan de una calibración permanente para poder dar esa exactitud. Cuanto mayor sea esa exactitud, menor será la cantidad de posibles fórmulas para el compuesto. Con una exactitud de 5 ppm para una molécula de 250 uma habrá muy pocas fórmulas pero para una de 500 pueden llegar a ser decenas. Para llegar a hacer masas de alta es conveniente que sepamos que: 1º el producto está puro y 2º el producto ioniza en el ESI o sea ya que haya analizado en un equipo de LCMS de baja resolución.

Espero que estas orientaciones les sirvan y que nos manden sus experiencias para que podamos conocer y manejar mejor esta, para nosotros, nueva herramienta.



Saludos Danilo



Gracias ]Danilo por tu aporte

1 comentarios:

Diver dijo...

excelente aporte Danilo, tenés razón, todo avanza tan rápido que es dificil saber a veces que tipo de experimentos nos pueden ser útiles...
nosotros hemos tenido muy buenas experiencias también con el Maldi-tof...
saludos y muchas gracias
Diver

 

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